社団法人　日本顕微鏡学会

誰か教えて！

このコーナーでは、皆様が日頃お持ちの顕微鏡に関する疑問・質問に、各分野の専門の会員がお答え致します。どうぞご利用下さい。
会員諸氏からの質問をお待ちしております。こちらからメールでお寄せ下さい。
なお、頂いた質問と、回答は適宜本コーナーに掲載させて頂きます。

Question1	透過電子顕微鏡でラットやマウスの網膜や色素上皮の観察を行ないたいのですが、目の固定方法や標本作成に関して通常の方法に比べて何か注意点などはあるのでしょうか？固定は還流固定などを利用した方が良いのでしょうか？それとも取り出した眼球をそのまま2.5％グルタールアルデヒドに入れてしまっても問題ないものなのでしょうか？

Question2	Q.1 昨今、電子染色に用いる酢酸ウラニルの使用規制があると聞きますが、試薬及び染色に使用する水溶液の保管状態、廃棄法等に関して会員諸氏が通常どのようになさっているか教えてください。学会として管理に統一した方法があるのでしょうか？ Q.2 生体組織のTEM観察の折にコントラストをあげるために酢酸ウラニルで染色をするようですが、残った酢酸ウラニルの処理についてユーザーから問い合わせがありました。ウランは核燃料物質にあたりますので、その計量については厳しく規制されているはずで、生物系でご使用の方はどのようにしておられるか知りたく思います。私自身は生体試料についてはまったくの素人ですので、ご教示いただければ幸甚です。よろしくお願いします。

Question3	最近蛋白分子の酢酸ウランを使った簡単なネガティブ染色法を行っておりますが、ろ紙でウランを吸い取る角度によってウランの残り具合が変わるというのですが、ウラン溶液濃度などの条件によってどの程度の染色液（ウラン）の厚みが変化するのか調べた論文または経験的な知見をお持ちの方がいらしたらお教えくださると助かります。よろしくお願いいたします。

Question4	クライオの電顕を組み立てております。試料の凍結不乾燥を目指しているのですが、不乾燥の評価で困っております。試料としては細胞を見たいと考えています。デモ試料として80%H2OのPVAを用いております。液体窒素を寒剤にした冷却機構を10-6Paのチャンバーに導入しております。乾燥（水分の昇華）の度合いをPVAの空孔で評価できるものでしょうか。何かアドバイスがありましたらよろしくお願いします。

Question5	非常に基本的な話で申し訳ありませんが、教えてください。SEM用前処理のイオンスパッタで、金属イオン（AuやPt）とカーボンスパッタ等がありますが、これらの使用用途を教えてください。また参考になるような書籍・URLなどありましたら、教えていただけませんか？

Question6	『走査型電子密度顕微鏡（法）』(Scanning Capacitance Microscopy, SCM)の測定原理を知りたく調べましたがなかなかデータがなく困っておりました。教えて頂けるのではないかと思いメールさせて頂きました。

Question7	Q1. 顕微鏡について「疑問」があり、インターネットでホームページをめぐっているうちに顕微鏡学会のページにたどり着きました。その疑問とは、「対物レンズは長いほど高倍率なのに、接眼レンズは長いほど低倍率なのはなぜか？」という疑問です。他のホームページを見ても、生物・物理の先生にうかがってもダメでした。顕微鏡学会に寄せられる他の質問をみると、大変高度で次元が違うようにも思えますが、一つお答えしてもらえないでしょうか。 Q2. 前回、光学顕微鏡について「対物レンズは長いほど高倍率なのに、接眼レンズは長いほど低倍率なのはなぜか？」という質問をした者です。前回の質問には早急かつ明快な回答をいただき本当にありがとうございました。対物レンズや接眼レンズの筒の中身は全部レンズ、の様なことを考えていますと、やはり、長いほど当然高倍率になる、の様に思っていました。対物レンズでは実像を、接眼レンズでは虚像をそれぞれ映していること、そして対物レンズでは、レンズが試料に近いほど大きく拡大でき、接眼レンズは、対物レンズの実像に近いほど大きく拡大できることがその秘密だったのですね。ところが、これがわかるとさらなる疑問が芽生えてきました。お答えくださった回答に「いつでも質問をお待ちしています。」とありましたので、それに甘えさせていただいて、もう一つ質問をよろしいでしょうか。それは「どうせ、対物レンズの倍率×接眼レンズの倍率＝顕微鏡の倍率、となるのだから、レンズは２枚必要なく、対物、もしくは接眼の片方だけあればよいのではないか。」という疑問です。回答にも「顕微鏡の対物レンズや，接眼レンズは，中央の水色のレンズのように通常２枚以上を組み合わせてあります。しかし，それらは結局１枚のレンズで置き換えることができるので，右側の赤いレンズのように描くことができます。」とありますので、どうせなら対物と接眼を一枚のレンズにもできそうな気がします。そうすれば、前回のような疑問を抱く必要もない（？）と思いますし、ほかにも、どうせ２枚を重ねるのであれば、実像と実像、虚像と虚像という組み合わせにすれば、視野が反転しないため、観察もしやすいと思いました。

Question8	実体顕微鏡または高倍率のマイクロスコープ下での細胞観察時の細胞染色試料について教えて下さい。ナガイモ等芋の断面の細胞について調べたいのですが、色が白いため、はっきり見ることができません。細胞壁等を染色する試薬を教えていただけませんか。

Question9	FIBのSIM像についての質問があります。 FIBのSIM像でGrainがよく観えることは一般的に知られています。弊社では、このGrain（FeNi系）に挟まれているAmo（NiP）膜≒40nm×20nmがSIM像で見づらい現象が起きています。試行錯誤していると、このNiP膜が鮮明に写し出される条件が見つかりました。 FIB　デポ銃（C）のシャッターをOPENして画面を1スキャンするとNiP膜が鮮明に確認できるのです。デポ銃（C）のシャッターOPENによって微量に表面へCがデポされる。しかしSIMで視野をスキャンしているのですから微量にデポされたCは削られる。この相反した状態で何故NiP膜がSIM像で観えるようになるのでしょうか？因みに、Grain（FeNi系）NiP膜を挟んでいるGrainはデポされた状態（Grainが観えていない）のままです。この状態で視野をSSIMで2スキャン、3スキャン、4スキャン・・・進めるに従って当然Cは蓄積されてNiP膜は観え難くなって行きます。どのような現象が起きているのでしょうか、教えてください。

Question10	下記写真を確認ください。　①　ＳＩＭ像　　②　DepoScan 1回目のＳＩＭ像ＦＩＢで切断した面をＳＩＭ像で観ているのが、①の写真です。此れにDepoScan 1回目のＳＩＭ像が②になっています。 ①のＳＩＭ像の中心付近（ＮｉＰ）の帯（白っぽく）が観えると思います。その周りの黒いコントラストはカーボンです。その中にチャンネリング現象が強く出ているのがＦｅＮｉ（棒状）になります。この左の状態を、ＦＩＢ内臓カーボンにてデポスキャンすると、②のＳＩＭ像が得られます。ＦｅＮｉのチャンネリング現象は無くなり、ＮｉＰが強調されるのが判ると思います。チャンネリング現象が無くなると言う事は、多少なりとも表面にカーボンがデポされたのでは？と推測します。であれば、何故ＮｉＰのコントラストはそのままに近い状態なのでしょうか？また、ＳＩＭはＧａイオン像であり、表面情報が優先されると解釈していますが、表面にカーボンが付いているのであれば、先に述べた、周りに付いているカーボンと同じコントラストになっても良いような気がするのですが？

Question11	低熱伝導ガラスのTEM試料作製方法、及び観察方法について教えてください。現在、機械研磨後にイオンミリング（Gatan　PIPS）で薄膜化（最終仕上げ3ｋV）を行いました。局所的に薄膜化されたのですが、FE-TEM　200ｋVで観察したところ、電子線で薄膜部が変形します。ダメージを与えないように集束レンズ絞りを広げて観察。変形は収まるのですが。ガラスのTEM観察は一般的にどのようなTEM（加速、LaB6、W）が適しているのでしょうか？また、試料作製時のイオンミリングダメージも気に掛かります。ミクロトームが良いのでしょうか？それ以外にも試料作製方法はあるのでしょうか？

Question12	こんにちは。はじめまして。顕微鏡については全くの初心者で、ぜひアドバイスをお願いします。このたび、顕微鏡を購入することになりました。見るものは、主に、細菌や、寄生虫、毛髪、カビ、染色した組織、などです。どのような機種のものが見やすく、（初心者にも使いこなせる）適しているのでしょうか？今までは大学などで、そこにある顕微鏡を使用していたので、特にその顕微鏡のメーカーや、価格、機種を考えたことがありませんでした。購入することになり、安い買い物でもなく、ずっと使って行きたいと思っていますので、一体どのようなメーカーのどのあたりのものを購入すればよいのか悩んでおります。私個人のものではなく、会社として購入するものなので、下手なものは購入できませんし、簡単に買い換えるわけにも行かない為に、選ぶ手がかりを探していたときに顕微鏡学会にたどり着かせていただきました。本当に初心者の馬鹿な質問で申し訳ありません。でも、悩んでおります。アドバイスよろしくお願い致します。

Question13	ぼくは中学一年生です。始めての中間テストに顕微鏡の名称を書く問題がありました。しぼり板と書き、×されました。しぼりとだけ書かないと×だと言われました。ほかの参考書にはしぼり板と書かれているものもあります。正式名称を教えて下さい。

Question14	LR-Whiteの事で大変困っております。貴学会のこのような素晴らしいコーナーの存在を知り、メールを送らせていただく次第です。もしよろしければ以下の文をお読みいただき、お答えいただけませんでしょうか？どうか宜しくお願い致します。 LR-Whiteの重合は熱、紫外線、加速剤添加ですが、オスミウム酸で後固定したサンプルをLR-White中で浸透させると、早い時で試料を入れてから40分後には勝手に重合してしまいました。もちろん、熱、紫外線にも曝しておりませんし、加速剤も添加しておりません。グルタールアルデヒドで前固定のみ行い、後固定しなかったサンプルでは、このような現象は起こりませんでしたので、オスミウム酸に原因があることが分かりました。今まで使用していたオスミウム酸が古かったので、新しいオスミウム酸で試してみたのですがまた同じ現象が起こってしまいました。文献やインターネットで調べているのですが、このような記述は見つかりません。日新EM株式会社さんと、応研商事さんにもお尋ねしたのですが、このような事例は報告されてないとのことでした。樹脂作製は次のようにして行いました。試料はゾウリムシです。＜前固定> 1. 8%の蔗糖を含む2%グルタールアルデヒド溶液／0.1 Mカコジル酸バッファー (pH 7.2) 4℃、30 min 2. 8%の蔗糖を含む0.1 Mカコジル酸バッファー (pH 7.2)で洗浄　4℃、30 min?overnight (この間に3回バッファーを交換) ＜後固定＞ 1%オスミウム酸／0.1 Mカコジル酸バッファー (pH 7.2)　 4℃、30 min ＜脱水＞ 50% エタノール　室温、10 min 70% エタノール　室温、10 min 90% エタノール　室温、10 min 99% エタノール　室温、15 min 無水エタノール　室温、15 min×2回　（硫酸銅またはモレキュラーシーブズで作製した無水エタノール）＜樹脂浸透＞ LR-White: 無水エタノール = 1 : 1　室温、1 h LR-White: 無水エタノール = 2 : 1　室温、1 h LR-White　室温、overnight (この間に勝手に重合) 長い文章をお読みいただきありがとうございました。失敗を繰り返し、前に進めずとても困っております。もし、ご意見やご指摘等がございましたら、お教えいただけませんでしょうか？お忙しいところ、大変恐縮ではございますが、どうぞ宜しくお願い申し上げます。

（平成１４年度電顕大学質問集より）

1.ハードウェア関連
	質問1.	各種電子銃の具体的な寿命を教えて下さい。

	質問2.	試料のドリフトを抑える方法はありますか？

	質問3.	FE電顕を用いた微少分析に適したの領域のオーダーを教えて下さい。

2.明視野法関連
	質問1.	転位をステレオ視する方法を勉強したいのですが、分かり易いガイドはないでしょうか？

3.高分解能電顕関連
	質問1.	フォーカスをジャストフォーカスをはさんで、アンダーからオーバーへ変化させると、フォーカスのステップ毎に、観察される格子像が変化しますが、これは、観察している結晶の違う断面を観察していると考えてもよろしいのでしょうか？（この現象から得られる情報は？）

	質問2.	格子像観察を行うにあたり，フォーカスが合っているのかが判断しづらいです。何か，フォーカス調整のポイントがあれば教えて下さい。

	質問3.	試料損傷について教えて下さい。動的変化を追っているのですが，長時間観察していると対象とする表面が壊れてしまいます。何か改善策はありますか。

4.エネルギー分散型ｘ線分光法(EDS)関連
	質問1.	EDS分析を行う際，得られたスペクトルで，ある元素が検出されたときに，それが試料中に存在する物か，周辺（ホルダーやメッシュ等）のホールカウントかを区別できる方法があれば教えて下さい。

	質問2.	EDSは数％程度の濃度がないと検出できないそうですが，入射ビームをごく小さく絞ったその領域内で数％あればよいのでしょうか。その場合，その微少領域をドリフトすることなく測定し続ける工夫が特別必要でしょうか。

5.電子エネルギー損失分光法(EELS)関連
	質問1.	EELSが軽元素の検出を得意とする理由はどこにあるのですか。

	質問2.	EELSでは元素分析の定量性はどの程度あるのでしょうか。

6.試料作製関連
	質問1.	FIBの100nm仕上げの後に、イオンミリングを使うと良い試料ができるのでしょうか。

	質問2.	粉末試料をEELS分析を十分にできるくらいまで薄くしたいのですが、今、粉末法ではあまり薄くならない状況です。どうしたらいいですか？

	質問3.	内部に空隙のある試料にFIB加工を行ったときにその空隙が埋まってしまうことはありますか。

7.走査プローブ顕微鏡関連
	質問1.	STM，AFMの分解能は何で決まるのでしょうか？

	質問2.	電流を流すと言うことは，エネルギーを試料に与えると言うことですが，それによっての影響（例えば，動的影響）は無視できるのでしょうか？

このほか電顕大学の質問回答集には、いろいろな事例が紹介されています。興味がおありの方はこちらまで。

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